使用小激活RNA(saRNA)增强SIRT1基因表达：逆转代谢综合征的新方法

代谢综合征 （MetS） 是一种以腹部肥胖、胰岛素抵抗、高血压和高脂血症为特征的病理状况。Sirtuin 1（SIRT1）是一种高度保守的组蛋白脱乙酰酶，其特征是对抗衰老相关疾病（包括MetS）的关键代谢调节剂和保护剂。在Nature Reviews Drug Discovery上发表的题为Small activating RNAs lead the charge to turn up gene expression的研究,在这项研究中，研究人员使用小激活RNA（saRNA）激活SIRT1的治疗潜力，从而减少炎症样反应并重新建立正常的脂质代谢。SIRT1 saRNA激活显著提高了脂多糖刺激和非刺激巨噬细胞中的 SIRT1 信使 RNA （mRNA） 和蛋白质水平。SIRT1 saRNA 通过降低关键炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子 α、白细胞介素 1 β （IL-1β）、白细胞介素 6 （IL-6） 和趋化因子单核细胞化学引诱蛋白-1 和角质形成细胞化学引诱剂）的 mRNA 水平，显著降低炎症样反应。SIRT1过表达还显着降低了核因子-κB和c-Jun N-末端激酶的磷酸化，这两种激酶都是炎症途径的关键信号分子。为了研究SIRT1上调的治疗效果，研究人员用SIRT1 saRNA与转铁蛋白受体适配体偶联以递送到肝脏和细胞内化处理了高脂肪饮食模型。SIRT1 saRNA治疗组中的动物表现出显着降低的体重增加，白色脂肪组织，甘油三酯，空腹血糖水平和细胞内脂质积累显着降低。这些提示治疗引起的动物脂质和葡萄糖代谢的变化。本研究结果表明，saRNA靶向激活SIRT1是逆转MetS的潜在策略。saRNA是短双链21-mer RNA寡核苷酸，其迭代设计用于增强靶向基因转录。它们的作用机制涉及将saRNA序列特异性加载到Argonaute 2（Ago2）中，以在细胞核内形成Ago2-RNA诱导的转录激活复合物介导的事件，以创建转录允许的环境。该复合物通过互补的碱基配对与基因组靶位点或重叠的非编码转录本结合，并诱导开放的染色质结构，在招募转录机制后，通过RNA聚合酶II导致转录活性增加. SIRT1的过表达抑制了促炎细胞因子和趋化因子的表达，降低了LPS刺激的巨噬细胞中NFκB和c-Jun N端激酶（JNK）的磷酸化。此外，研究证明对HFD大鼠施用TfR-SIRT1导致血清脂质，细胞内脂质积累和脂肪组织组成降低。与对照组相比，葡萄糖代谢也正常化。上述研究结果表明，SIRT1 saRNA可能构成治疗MetS的新型治疗候选药物。

saRNA诱导RAW264.7细胞中SIRT1上调

使用脂质胺2000将靶向SIRT1（称为SIRT1-PR57）的saRNA转染到RAW264.7细胞中。72 h后通过定量聚合酶链反应测定SIRT1的基因表达分析。与对照组（20 nM FLUC）相比，转染20 nMSIRT1-PR57的细胞显示SIRT1 mRNA水平（P< 0.05）显着增加2.0倍。我们测量了saRNA转染细胞中的SIRT1蛋白表达水平，与对照组（20 nM FLUC）相比，观察到SIRT1蛋白水平（P<0.01）显着增加1.7倍（图1a-c）。使用十个纳摩尔si-SIRT1来验证寡核苷酸诱导的SIRT1 mRNA和蛋白质水平的变化（图1a-c）。

图1.SIRT1-PR57在非LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中诱导特异性基因激活。（a）用20 nM SIRT1-PR57或10 nM si-SIRT1转染后SIRT1 mRNA水平的qPCR。（二）用 20 nM FLUC、20 nM SIRT1-PR57 或 10 nM si-SIRT1 转染后对 SIRT1 进行蛋白质印迹。（三）用于蛋白质印迹指示条件的条带密度测定法。与FLUC转染相比，指定条件的统计学意义：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。一式三份进行三次独立的实验运行。误差线代表 SEM。 FLUC，萤火虫荧光素酶的siRNA;LPS，脂多糖;信使核糖核酸，信使核糖核酸;qPCR，定量聚合酶链反应;SEM，平均值的标准误差;SIRT1， Sirtuin 1;未转染。

SIRT1-PR57 降低 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞中的促炎细胞因子和趋化因子

将RAW264.7细胞暴露于细菌LPS（100ng / mL）3小时以诱导免疫调节分子的表达（S1）。相对于未受刺激的RAW264.7细胞，IL-1β水平增加了约3，000倍，IL-6∼增加了140倍，KC ∼100倍（图2b-e）。LPS刺激的RAW264.7细胞中的SIRT1水平显着降低（0.6倍）（图2a）。

图2.LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞中 SIRT1、促炎细胞因子和趋化因子的内源性 mRNA 水平。qPCR 用于 （a）SIRT1 mRNA 水平、（b）IL-1β mRNA 水平、（c）IL-6 mRNA 水平、（d）KC mRNA 水平和 （e）MCP1 mRNA 水平 （ND） 在存在或不存在 LPS （100 ng/mL） 的情况下 3 小时。与非LPS刺激的细胞相比，在指示条件下显示的统计学显着性：*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。一式三份进行三次独立的实验运行。误差线代表 SEM。 IL，白细胞介素;KC，角质形成细胞化学引诱剂;MCP1，单核细胞化学引诱蛋白-1;ND，无法检测到.

研究人员评估了用SIRT1-PR57预调节RAW264.7细胞以上调SIRT1如何影响LPS刺激的这些免疫调节分子的诱导,当细胞转染SIRT1-PR57时，LPS刺激后TNFα（0.6倍），IL-1β（0.4倍），IL-6（0.5倍），KC（0.5倍）和MCP1（0.8倍）减少（图3b-f）。尽管暴露于LPS，SIRT1-PR57转染的RAW264.7细胞中的SIRT1水平仍然显着升高（2.1倍）（图3a）。当使用SIRT1特异性siRNA敲低SIRT1水平时，观察到相反的情况（图3a-f）。SIRT1 saRNA抑制了免疫调节分子的LPS诱导。

图3.SIRT1-PR57诱导LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中的特异性基因激活并抑制促炎细胞因子和趋化因子的产生。qPCR 用于 （a）SIRT1 mRNA 水平、（b） TNFα mRNA 水平、（c）IL-1β mRNA 水平、（d）IL-6 mRNA 水平、（e）KC mRNA 水平和 （f）MCP1 mRNA 水平，在 LPS （100 ng/mL） 存在下 3 小时。在LPS刺激的细胞中，与10 nM非靶向siRNA和20 nM FLUC相比，在指定条件下显示的统计学意义：* P< 0.05，**P< 0.01，*** P< 0.001。一式三份进行三次独立的实验运行。误差线代表扫描电镜。 siRNA，小干扰RNA;TNFα，肿瘤坏死因子α。

SIRT1-PR57 抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞中的 NFκB 和 JNK 磷酸化

研究评估SIRT1 saRNA （SIRT1-PR57）对NFκB信号传导的影响，在Ser536NFκB的RelA/p65亚基作为LPS/Toll样受体4（TLR4）途径的一部分进行了研究[18]。LPS刺激后，NFκB磷酸化（Ser536）在10分钟内达到峰值（图4a）。当RAW264.7细胞用20nM SIRT1-PR57预转染以增加内源性SIRT1水平时，这种效应显着下调（图4b-d）。在这项研究中观察到磷酸化的JNK（Thr183/Toll185）在p54和p46亚型（图4e，f）。当用SIRT1-siRNA敲低SIRT1水平时观察到相反的效果（图4e，g），这表明巨噬细胞中的LPS刺激通过JNK的翻译后修饰增强了促炎细胞因子和趋化因子的表达。

TfR-SIRT1治疗改善HFD大鼠模型中的肝脂代谢

用HFD喂养14周的动物在治疗开始时根据体重随机分为四组，并通过尾静脉每周一次静脉注射PBS，TfR-FLUC 3mg / kg或TfR-SIRT1 3mg / kg。测定大鼠的重量，用TfR-SIRT1（P<0.001）处理的大鼠显着减少（图5a）。

图 5.TfR-SIRT1治疗对HFD模型大鼠体重、肝脂和血糖的影响。HFD模型大鼠中的油红O染色和IHC。F344大鼠，喂食HFD14周，在治疗开始时按体重随机分组，并注射PBS，TfR-FLUC 3mg / kg或TfR-SIRT1 3mg / kg，每周一次IV通过尾静脉12周。（一）治疗后体重变化和（b）白色脂肪组织重量。血清中（c）总胆固醇，（d）高密度脂蛋白，（e）低密度脂蛋白，（f）高密度脂蛋白/低密度脂蛋白比值，（g）TG，（h）TG/高密度脂蛋白比值和（i）葡萄糖水平。（j）用油红O溶液每周一次静脉注射PBS，TfR-FLUC 3mg / kg或TfR-SIRT1 3mg / kg的HFD大鼠模型的肝脏切片染色。（十一）在注射 PBS、TfR-FLUC 3 mg/kg 或 TfR-SIRT1 3 mg/kg 的 HFD 大鼠模型的 5 μm 厚的肝脏切片中进行 SIRT1 染色。针对指示条件显示的统计显著性：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。误差条表示 SEM。 箭头表示 SIRT1 染色阳性增加。高密度脂蛋白，高密度脂蛋白;HFD，高脂肪饮食;免疫细胞癌，免疫组织化学;静脉注射;低密度脂蛋白，低密度脂蛋白;PBS，磷酸盐缓冲盐水;TfR，转铁蛋白受体;TG，甘油三酯。

在这项工作中，研究人员找到saRNA激活SIRT1表达后LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子和趋化因子减少的证据。此外，在HFD大鼠模型上发现SIRT1过表达在肝脏代谢和脂质生物标志物正常化方面的积极影响，使用先前开发的TfR适配体，与SIRT1 saRNA（TfR-SIRT1）偶联用于全身递送。研究结果表明，SIRT1 saRNA通过作为MetS的抗炎剂具有作为治疗候选药物的潜力。

原文链接:https://doi.org/10.1038/d41573-021-00127-2 

参考文献:

1. Voutila J, V Reebye , TC Roberts , P Protopapa , P Andrikakou , DC Blakey , R Habib , H Huber , P Saetrom , et al. (2017). Development and mechanism of small activating RNA targeting CEBPA, a novel therapeutic in clinical trials for liver cancer. Mol Ther 25:2705–2714. 

2.  Zhao X, V Reebye , P Hitchen , J Fan , H Jiang , P Saetrom , J Rossi , NA Habib and KW Huang . (2019). Mechanisms involved in the  activation of C/EBPalpha by small activating RNA in hepatocellular carcinoma. Oncogene 38:3446–3457.

3.  White PJ and A Marette . (2014). Potential role of omega-3-derived resolution mediators in metabolic inflammation. Immunol Cell Biol 92:324–330.

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