小激活saRNA靶向 p21 (WAF1/CIP1)基因抑制兔模型中增殖性玻璃体视网膜病变

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研究背景

PVR 是玻璃体和/或视网膜周围异位细胞片增殖后的一种疾病过程，在风源性视网膜脱离（RRD）患者中引起视网膜周围膜形成和牵拉，是原发性 RRD 玻璃体视网膜手术后失败的主要原因。PVR见于5%-10%的RRD，75%的RRD与手术后再脱离有关，是RD成功修复的主要障碍。研究发现,RPE细胞迁移和增殖的基础有不同的信号，包括失去接触、对玻璃体中存在的因子的反应以及炎症细胞的分泌物。

p21由CDKN1A基因编码的蛋白（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A）是一种明确的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的Cip/Kip家族，是细胞死亡、DNA修复和衰老等各种细胞过程的关键介质。p21过表达导致G1期和G2期或S期停滞[8]。由各种转录因子（p53、Sp1/Sp3和c-Myc）介导的转录调控在p21的表达和活性中起关键作用。p21 是一种抑制细胞增殖的基因，尽管 p21 中的功能丧失突变很少见。因此，p21是RNA介导的抑制细胞生长的理想靶标。

RNA激活（RNAa）是一种基因调控机制，通过该机制，启动子靶向的小激活RNA（saRNA）以序列特异性方式诱导转录基因激活。saRNA靶向激活治疗基因已在多种疾病模型中得到证实，包括癌症和非癌性疾病。一种旨在激活抑癌基因CEBPA的saRNA药物正处于治疗肝癌的II期试验中。

saRNA引导的p21激活已被证明对各种肿瘤细胞以及良性细胞具有抗增殖作用，并在癌症动物模型中表现出抗肿瘤作用。 既往研究表明，在兔PVR模型中，通过腺病毒载体过表达兔p21对PVR的发生具有抑制作用。此外，在氧诱导的视网膜病变（OIR）大鼠模型中，腺病毒载体介导的p21递送抑制了视网膜新生血管形成（RNV）。这些研究表明，p21可能saRNA预防或治疗PVR的治疗靶点。

材料与方法(此处略)

实验结果

RAG1-40-53 诱导 ARPE-19 细胞中 p21 表达和细胞停滞

诱导 ARPE-19 细胞中 p21 的表达: 在细胞中以不同浓度在细胞中转染具有化学修饰的 p21 启动子靶向 saRNA （RAG1-40-53） 72 小时。如图1A所示，与模拟转染相比，1、5和10 nM的RAG1-40-53分别引起1.97、3.8和3.66倍的p21 mRNA诱导，而较高浓度（50 nM）的p21表达没有进一步增加（3.30倍）。为了评估 RAG1-40-53 激活 p21 对 ARPE-19 细胞的潜在抗增殖影响，在转染 RAG1-40-53 后，以 0.01 nM 至 50 nM 的不同浓度，持续时间为 1 天至 7 天，通过 CCK-8 测定法对活细胞进行计数。如图 1B 所示，外推 IC 对细胞活力的剂量和时间依赖性抑制是明显的₅₀第 3 天为 0.36 nM。为了进一步确定活力下降是由于细胞抑制作用还是细胞毒性作用，将活力数据绘制为相对于第 0 天（治疗前）的活细胞百分比。如图1C所示，与预处理相比，RAG1-40-53在所有浓度下处理ARPE-19细胞均未导致活细胞数净减少，表明RAG1-40-53对ARPE-19细胞具有细胞抑制作用，而不是细胞抑制作用，这是玻璃体内治疗的重要安全特性。

图 1. RAG1-40-53 诱导 p21 mRNA 表达并在 ARPE-19 细胞中引起细胞抑制作用。

（A）将 ARPE-19 细胞转染指定的双链体 72 小时，从处理细胞中分离 RNA 并逆转录将 RNA 转化为 cDNA 后，通过 RT-qPCR 评估 p21 的 mRNA 表达。（B）用指定浓度（范围为 0.01、0.05、0.1、0.5、1,5、10、25 至 50 nM）的 RAG1-40-53 转染 ARPE-19 细胞，转染持续时间为 1 至 7 天。使用 CCK-8 试剂盒对活细胞进行计数，并绘制为对照处理的百分比（B）和转染前（第 0 天）的百分比（C）。误差线表示两个独立实验的平均SEM。*P < 0.05，***P < 0.001。

RAG1-40-53 抑制 ARPE-19 细胞的细胞周期进程

为了确定观察到的 RAG1-40-53 抗增殖作用的药理机制，在 PI 染色后通过流式细胞术评估 ARPE-19 细胞的细胞周期谱。如图2A所示，与对照组相比，RAG1-40-53处理的细胞G0/G1细胞群增加有统计学意义，S细胞群同时减少（P < 0.05）。结果表明，RAG1-40-53 将 ARPE-19 细胞的细胞周期阻滞在 G0/G1 期。

图 2. RAG1-40-53（saRNA）可减轻ARPE-19细胞的细胞周期和细胞毒性。

（A）不同浓度saRNA对照组和转染组的流式细胞术循环。条形图表示Mock、dsCon2和RAG1-40-53（1nM、5nM、10nM、50nM）组RPE细胞周期分布的定量数据。每个值代表两个独立实验的平均值±SD。每个都以副本形式执行。saRNA转染组与对照组差异有统计学意义（*P < 0.05，**P<0.001）。（B）细胞凋亡分析用于确定saRNA（RAG1-40-53）是否对ARPE-19细胞有毒。转染saRNA组与对照组的细胞毒性差异无统计学意义。

为了评估体外安全性并进一步支持RAG1-40-53主要诱导细胞抑制作用而不是细胞毒性作用的发现，在膜联蛋白V和PI染色后通过流式细胞术评估细胞凋亡。如图2C所示，用不同浓度（1、5、10和50 nM）的RAG1-40-53处理后，凋亡细胞的比例没有显著变化，表明RAG1-40-53既不会对ARPE-19细胞产生毒性，也不会诱导细胞凋亡。

RAG1-40-53 抑制 TGF-β 诱导的 ARPE-19 细胞迁移

为了确定 RAG1-40-53 诱导 p21 是否对细胞运动和迁移有影响，在存在和不存在 TGF-β1 （10 ng/mL）的情况下用 RAG1-40-53 转染 ARPE-19 细胞，TGF-β1 （10 ng/mL）是一种已知诱导上皮间充质转化（EMT）的生长因子，从而促进细胞运动和侵袭性。如图 3A 和 3B 所示，在 TGF-β1 存在下，对照处理（无治疗、模拟和 dsCon2）中的细胞表现出愈合伤口面积的减少，表明运动受到刺激。然而，与对照组相比，RAG1-40-53（10 nM）处理在不同时间点（24、48和72 h）对细胞运动有显著的抑制作用。该结果表明，RAG1-40-53诱导p21可以抑制TGF-β1诱导的EMT和运动，这是PVR的重要致病过程。

图 3. RAG1-40-53-C1 对 ARPE-19 细胞迁移的影响。

（A）划痕试验，ARPE-19细胞在0h、24h、48h、72h的伤口愈合;（B）转染saRNA组伤口愈合面积与3个对照组差异有统计学意义。（* P < 0.05）

胆固醇偶联的 RAG1-40-53 在游离摄取处理中抑制 ARPE-19 细胞增殖

为了能够测试 RAG1-40-53 的体内治疗效果，该双链 saRNA 通过其正义链 3' 端的接头与胆固醇部分偶联，产生 RAG1-40-53-C1。通过CCK-8测定法分析添加RAG1-40-53-C1的ARPE-19细胞的活力。如图 4 所示，RAG1-40-53-C1 处理以剂量依赖性方式降低 ARPE-19 细胞活力，计算出 IC₅₀在 0.9 μM 时值，在 10 μM 时最大抑制 27%。

图 4. 胆固醇偶联的 RAG1-40-53 在游离摄取处理中抑制 ARPE-19 细胞增殖。

发现 RAG1-40-53-C1 处理以剂量依赖性方式降低 ARPE-19 细胞活力，计算出 0.9 uM 时的 IC50 值和 10 uM 时的最大抑制 6x%。

玻璃体内给药的 RAG1-40-53-C1 持久保留在兔眼中，全身暴露最小

为了确定玻璃体内给药RAG1-40-53-C1的药代动力学（PK），将15只健康新西兰兔分为3组，每组5只：生理盐水，RAG1-40-53-C1低剂量（0.1mg）和RAG1-40-53-C1高剂量（0.3mg）。在第 0 天将生理盐水或 RAG1-40-53-C1 注射到玻璃体腔中。第2、4、6、8天采集前体液、玻璃体液和血浆，采用茎环qPCR检测RAG1-40-53-C1浓度。通过将已知量的 RAG1-40-53-C1 加标到未经处理的兔子的前体液、玻璃体液和血浆样品中来生成标准曲线。如图 5A 所示，玻璃体液中含有最高且剂量依赖性的 RAG1-40-53-C1 浓度，该浓度在 8 天内缓慢下降。RAG1-40-53-C1在前体液中的浓度明显低于玻璃体液中，并且在8 d内保持非常稳定。在玻璃体液中，RAG1-40-53-C1 表现出剂量依赖性 C_麦克斯在4小时时，0.1和0.3mg治疗组分别为1903.6和3149.8 nM。在等离子体中，C_麦克斯RAG1-40-53-C1分别为0.04 nM和0.62 nM，分别为玻璃体液的0.002%和0.019%。这些数据表明，玻璃体内给药的 RAG1-40-53-C1 在玻璃体液中保持持久的浓度，同时全身暴露最少。

图 5. 玻璃体内给药的 RAG1-40-53-C1 持久保留在兔眼中，全身暴露最小。

（A）通过将已知量的 RAG1-40-53-C1 加标到前体液、玻璃体液和未经处理的兔子的血浆样品中来生成标准曲线。（B）第2、4、6、8天采集前体液、玻璃体液和血浆，采用茎环qPCR法测定RAG1-40-53-C1浓度。（*p<0.05;**p<0.01）。

RAG1-40-53-C1诱导兔眼p21表达

为了评估RAG1-40-53-C1的体内药效学特性，将ARPE-19细胞与RAG1-40-53-C1混合，然后注射兔玻璃体。从注射兔眼 14 天回收的细胞中评估 p21 mRNA 表达。如图 5B 所示，与生理盐水或对照 saRNA 处理相比，RAG1-40-53-C1 可显著诱导 p21 mRNA。

RAG1-40-53-C1 抑制兔 PVR 模型中的 PVR 进展

为了测试 RAG1-40-53-C1 抑制 PVR 发展的功效，通过注射 2.5 × 10 在兔眼中创建 PVR 模型⁵ARPE-19细胞进入26只健康新西兰白兔左眼的玻璃体液中。第 14 天，进行 OCT 和眼底成像以评估眼内 PVR 的形成（图 6B）。将PVR评分高于2分的眼睛随机分为4组：对照组（PBS）、甲氨蝶呤组、RAG1-40-53-C1组（0.1 mg）、RAG1-40-53-C1组（0.3 mg）、RAG1-40-53-C1组（1 mg），每组4只PVR模型眼（表1），第15天接受玻璃体内治疗（图6A）。治疗后 7 天（第 22 天），重新进行 OCT 和眼底成像以评估 PVR 的发展。

图 6. RAG1-40-53-C1（saRNA）抑制 ARPE-19 细胞的纤维化并降低体内 PVR 的等级。

（A）在兔子眼中构建PVR活体模型，并通过眼底摄影观察随时间的变化。（二）药效试验时间表。（三）药效试验。RAG1-40-53-C1注射液诱导兔眼P21 mRNA表达增加。黄色圆圈表示纤维状新膜状材料。PBS组、MTX组、saRNA转染组（RAG1-40-53-C1 0.1mg、RAG1-40-53-C1 0.3mg、RAG1-40-53-C1 1.0mg）。第14天和第22天，眼底照相和OCT观察PVR的变化。（*P < 0.05，**P < 0.01）。如图所示，，细胞注射7 d后，PBS组眼底照相显示玻璃体腔浑浊，疑似有玻璃体出血，黄斑内有白色条纹物质。MTX组眼底照相显示，治疗后视网膜扁平、血管正常，无明显扩张、迂曲、出血。

RAG1-40-53-C1组眼底照相显示，随着治疗剂量的增加，黄斑前膜明显改善。视网膜血管比PBS组更清晰，未见眼底出血。在OCT检查中，如图6C中黄线虚线勾勒的区域所示，PBS组的眼睛显示出明显的黄斑前膜牵拉和水肿，以及黄斑区域视网膜神经上皮增厚。相比之下，MTX 和 RAG1-40-53-C1 组的眼睛显示出黄斑和周围纤维膜的增殖显着减少。这些结果表明，RAG1-40-53-C1治疗PVR可显著减缓PVR的进展，且治疗效果随着剂量的增加而更加明显。

讨论

PVR 是流源性视网膜脱离矫正手术后发生的常见并发症，目前尚无 FDA 批准的药物治疗。在本研究中，RAG1-40-53（一种旨在靶向 p21 基因启动子的 saRNA 在转录水平上诱导其表达）在通过注射人 RPE 细胞建立的兔子模型中测试了抑制 PVR 发育的潜力，本研究结果支持 RAG1-40-53 的治疗效果。

RPE细胞迁移和EMT是PVR发育的关键过程，如果没有这些过程，RPE细胞就无法转化为肌成纤维细胞样细胞，获得更多的能量进入玻璃体腔并沉积在视网膜表面，从而有助于增殖网膜的形成。在这项体外研究中，RAG1-40-53 通过引起 p21 过表达来抑制 RPE 细胞迁移。RPE细胞的迁移取决于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）信号通路。此外，p21诱导的细胞周期进程和存活取决于PI3K/AKT和c-Myc信号通路的激活。因此，p21抑制RPE细胞迁移的机制可能涉及PI3K/AKT信号通路。我们旨在在进一步的实验中验证这些结果。

构建PVR体内模型了解saRNAs在体内的作用。眼内注射ARPE-19细胞是诱导玻璃体增殖反应和建立PVR动物模型的常用方法。注射后大约 2 周内达到峰值，牵引性视网膜脱离发生在 3-4 周。先前的体外研究表明，p21 的表达从第 2 天开始，在第 3 天达到峰值，持续 1 周。因此，我们在 PVR 诱导后 7 天内以不同剂量给予 RAG1-40-53-C1。眼底显微镜和OCT显示，实验组增殖膜发育和视网膜脱离程度均小于对照组。增殖膜发育和视网膜脱离与甲氨蝶呤组相当。这些结果与体外实验的结果一致。P21 ^WAF1/CIP1^型被认为是一种重要的CDKI，具有广泛的激酶抑制活性，可有效抑制细胞周期，阻止细胞通过G1/S期检查点，从而抑制细胞增殖。研究表明，p21抑制肿瘤细胞的迁移和增殖，包括肝脏和肺细胞。 PVR与癌症有许多相似之处，许多获批的抗增殖药物和细胞周期阻断药物已在临床试验中测试用于治疗PVR。此外，p21在源自人RPE细胞的ARPE-19细胞中表达较低，这在PVR发病机制中起重要作用。p21可以在体外抑制RPE细胞的增殖和迁移，并在体内抑制PVR。

研究总结, 本研究已经测试了一种基于RNA的新型治疗方法，用于治疗PVR。通过使用 p21 特异性 saRNA 激活 p21 的表达，p21 是细胞周期的主要负调节因子和细胞衰老诱导剂，我们证明可以抑制人 RPE 细胞的增殖和迁移，而不会检测到细胞死亡或凋亡。将胆固醇部分与saRNA偶联允许在玻璃体内给药后在玻璃体空间中可持续保留，并具有体内药理活性。通过单次玻璃体内注射 saRNA 进一步处理兔模型中已建立的 PVR 减缓了 PVR 的进展。本研究的结果保证了 p21 saRNA 治疗 PVR 的进一步开发。